第一版，2017年3月
本说明包含酷搏科技人源DNA定量试剂盒（产品号：HS100-500）使用方法及注意事项。本说明为简明版，适合有一定经验的使用者阅读。若需要关于本试剂盒的原理、组成及使用方法的详细介绍，请参阅酷搏科技人源DNA定量试剂盒使用手册。若需要了解q225荧光定量PCR系统及配套软件的操作方法，请参阅Quantagene q225荧光定量PCR系统使用手册。
每套酷搏科技人源DNA定量试剂盒包含下方列出的6管试剂及一份快速使用说明，单个试剂盒可以在酷搏科技q225荧光定量PCR系统上进行总共500次qPCR反应。
2X qPCR 反应液简称 Q
1.25ml * 2管
含有DNA聚合酶，dNTP，SYBR Grenn荧光染料
总定量引物简称 T
1.00ml * 1管
含有人源总DNA基因定量PCR扩增引物
Y定量引物简称 Y
1.00ml * 1管
含有人源Y染色体DNA基因定量PCR扩增引物
人DNA定量标准品简称 S
100μl * 1管
相当于20ng/μl的人类男性总基因组DNA浓度的标准样品
此标准样品的唯一用途为配合本试剂盒用于人源DNA定量，不能用于任何其它目的。如使用吸光法、荧光法等方法测量此标准样品中的总DNA浓度，均不能得出正确的浓度。具体见酷搏科技人源DNA定量试剂盒使用手册 的应用原理部分。
纯水简称 W
1.00ml * 1管
纯水
- 标准样品的梯度稀释
- 将试剂盒内的标准样品于室温下融化，置于漩涡混匀仪上震荡3-5秒后离心
- 根据下表对标准样品进行4倍浓度梯度稀释，得到5个不同浓度的标准样品。稀释过程中每一步需在漩涡混匀仪上震荡至少5秒，并在震荡后离心使得管内液体全部集中在管底后再进行下一步移液。
| 样品浓度(ng/μl) | 从上一浓度样品内吸取液体体积(μl) | 纯水体积 (μl) |
| 20 | 原始标准溶液 | - |
| 5.0 | 20 | 60 |
| 1.25 | 20 | 60 |
| 0.312 | 20 | 60 |
| 0.078 | 20 | 60 |
如果用户使用同一批号的本试剂盒，在q225荧光定量PCR仪上运行，且保证操作步骤、试剂配比完全一致，试剂盒的存储条件得当，可以使用同一标准曲线进行计算而不需每次实验都包含标准样品。此时，只需要使用初始浓度样品 (20 ng/μl) 作为阳性对照并使用DNA提取洗脱液作为阴性对照即可。用q225仪器配套的软件可导入其他运行文件内的标准曲线数据进行计算。如使用不同批次的试剂盒，或使用不同的样品稀释方法，或在非q225荧光定量PCR仪上使用本试剂盒时，必须每次运行时都包括5个连续稀释得到的不同浓度标准样品和阴性对照。
- qPCR反应溶液的配制
取出试剂盒内的2x qPCR反应液、总定量引物和Y定量引物，于室温下融化。将各引物溶液置于漩涡混匀仪上震荡3-5秒，手持上下颠倒或使用移液器温和吹打混匀2x qPCR反应液。混匀后将各管试剂离心。
依据下表及样品总数（包括标准样品、阳性对照、阴性对照及待测样品）计算实验所需各组分体积，所配制的溶液体积应较实际所需体积大10%。将各组分加入至体积合适的离心管，震荡混合均匀并离心。
| 组分 | 每一样品每种引物实验所需体积（μl）* |
| 总定量引物或Y定量引物 | 8.8 |
| 2x qPCR反应液 | 11 |
*表中所示为每一样品每种引物进行两个平行反应时的试剂用量（已包含多加入的10%），每个反应总体积为10 μl，故对于每一样品每种引物需配制20 μl反应溶液。若需要进行三个平行反应，请自行根据比例增加用量。后文所提及用量同理，不再赘述。
将离心后的混合溶液加入到离心管或八联排管内，每管加入18μl。注意记录各管内所加溶液包含的引物种类。
每个反应孔板内必须包含至少一份阴性对照和一份阳性对照，可直接使用试剂盒内的20 ng/μl定量标准品作为阳性对照，同时使用当次DNA样品提取过程中的洗脱溶液作为阴性对照（若提取不包含洗脱步骤，则使用溶解DNA的最后一步提取试剂）。将充分混匀且离心后的标准样品、待测样品、阴性对照溶液和阳性对照溶液加入到已添加混合溶液的各离心管或八联排管内，每管加入2 μl。每个样品分别加入到一个含总定量引物和一个含Y定量引物的管内。注意记录各管所加样品名称。完成后盖好各管，充分震荡混匀并离心。
注意：每次定量过程中都必须使用当次DNA样本提取时的洗脱溶液（若提取不包含洗脱步骤，则使用提取试剂）作为空白对照进行一组实验。当空白对照样品的Ct值大于32时体系被认为是无污染的，定量结果可信。若空白对照样品的Ct值持续小于30，可使用标准样品试剂盒中提供的纯水进行空白对照实验，以便确定污染来自于基因定量试剂盒中的组分或DNA提取过程中所使用的试剂。
3. 使用q225荧光定量PCR系统进行实验
取出专用小型孔板，每管溶液分配至两个孔内，每孔加入。此步骤推荐使用可变间距电动多通道移液器进行。完成后使用配套封板膜密封孔板，离心除去孔内气泡并使得溶液集中于管底。
将孔板放入q225荧光定量PCR仪准备进行实验，默认的qPCR反应程序设置参见下表。
|
步骤名称
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进行次数
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温度 (°C)
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时间 (s)
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预变性
|
1次
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98
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60
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循环反应
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40次
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98
|
5
|
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60
|
15
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熔解曲线
|
1次
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60-95
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约5 min |
启动q225荧光定量PCR仪及配套电脑，将电脑网络连接至仪器WIFI，打开电脑桌面上的人源DNA定量分析软件，输入实验相关信息与孔板信息，开始实验。（软件部分具体操作方法详见q225荧光定量PCR系统使用说明）。
注意：将本试剂盒应用于其他荧光定量PCR仪时的实验操作、反应程序及注意事项详见酷搏科技人源DNA定量试剂盒使用手册，下载请访问酷搏科技官方网站www.kubotechnology.com。
与q225配套的人源DNA定量分析软件包含对以下项目的结果分析：
- 阴性对照：一般阴性对照Ct在32以上，认为反应体系和DNA提取过程中无人源DNA污染。如达不到此要求，则较同方法阴性对照的平均Ct小3以上的样品也认为结果准确。
- 标准曲线：一般总定量引物和Y定量引物的标准曲线R2 > 0.99 (一般R2在0.995-1.000间)。如满足试剂批号相同、使用q225、操作和试剂配比相同、试剂储存得当，可以调用之前运行的标准曲线数据进行定量计算。
- 阳性对照Ct：阳性对照为20 ng/μl定量标准品时，总定量引物的Ct值范围在15.8-17.2之间（一般在16.1-16.8之间），Y定量引物Ct值范围在18.1-19.5之间（一般在18.4-19.1之间）。
- 重复间差异：Ct<25时，重复孔间Ct差异低于0.5；25<Ct<28时，重复孔间Ct差异低于1.0。
- 熔解曲线与解链温度：总定量引物和Y定量引物的参考Tm分别为80.2±1.0 °C和81.6±1.2 °C，在熔解曲线的负一阶导数图上显示为较尖锐的单峰。