酷搏科技人源DNA定量试剂盒

产品号 HS100-500
2017年3月
 
为了使本试剂盒对人源DNA定量达到最佳效果和准确、快速、经济目的，建议将本试剂盒与酷搏科技q225荧光定量PCR仪配套使用。本使用说明默认用户使用酷搏科技q225荧光定量PCR仪。
 本试剂盒也可在其它大多数的荧光定量PCR系统上使用。如果用户不使用q225荧光定量PCR系统，请阅读本使用说明的“使用非q225系统”部分，以确保用户能够得出正确的定量结果。

  使用目的

酷搏科技人源DNA定量试剂盒基于荧光定量PCR（qPCR）原理，用于对DNA样品中人源总DNA和人源男性DNA进行定量。
 
本试剂盒可用于为法医学目的提取的DNA样品，定量其中人源总DNA和人源男性DNA。此定量步骤可以作为STR检测、高通量测序或其它应用之前的定量步骤。
 
本试剂盒不得用于医疗诊断目的。

  试剂盒组分

每套酷搏科技人源DNA定量试剂盒可以在酷搏科技q225荧光定量PCR系统上进行总共500次qPCR反应。内容如下：
 
  2X qPCR 反应液
简称 Q
1.25ml * 2管
含有DNA聚合酶，dNTP，SYBR Grenn荧光染料
 
  总定量引物
简称 T
1.00ml * 1管
含有人源总DNA基因定量PCR扩增引物
 
  Y定量引物
简称 Y
1.00ml * 1管
含有人源Y染色体DNA基因定量PCR扩增引物
 
  人DNA定量标准品
简称 S
100μl * 1管
相当于20ng/μl的人类男性总基因组DNA浓度的标准样品
此标准样品的唯一用途为配合本试剂盒用于人源DNA定量，不能用于任何其它目的。如使用吸光法、荧光法等方法测量此标准样品中的总DNA浓度，均不能得出正确的浓度。具体见本说明的应用原理部分。
 
  纯水
简称 W
1.00ml * 1管
纯水 

  储存条件

酷搏科技人源DNA定量试剂盒的长期推荐储存温度是-20°C。在未开封状态，并保持-25°C到-15°C间的储存条件下，本试剂盒从标注的生产日期起可以保存18个月。
 
如需短期保存或短期运输，可以将本试剂盒短期放置在4°C。在0-5°C的保存条件下，本试剂盒的累积保存期限为20天。
 
用户在操作时，可以将本试剂盒短暂放置在20-25°C的常温条件下。本试剂盒在常温下的累积存放时间为24小时。

   所需其他材料与试剂

  • qPCR系统，建议使用酷搏科技q225荧光定量PCR系统
  • DNA提取试剂盒，或DNA提取工作站，或配合有DNA提取功能的移液工作站
  • 桌面离心机或手掌式离心机，适合1.5 / 2ml小管
  • 桌面离心机或手掌式离心机，适合8排管（0.2ml）
  • 漩涡混匀仪
  • 合适的移液器（可以使用手动单通道移液器、电动单通道移液器、电动多通道可调间距移液器）或移液工作站
  • 配套的移液吸头（建议使用包含滤芯的吸头）
  • 1.5 mL或 2 mL小管（分子生物学洁净）
  • 8排管（0.2 mL，分子生物学洁净）
  • 无粉乳胶手套或无粉丁腈手套
 
请确保所有的仪器均正确安装和并已接受定期校准与维护。

   试剂盒应用原理

酷搏科技人源DNA定量试剂盒基于荧光定量PCR方法，可对样品中的人源DNA进行准确定量。
 
试剂盒中有两套PCR引物：总定量引物和Y定量引物。总定量引物可以特异性扩增位于人1号染色体上的某多拷贝片段DUF1220。人类基因组的一条1号染色体上平均约有55个DUF1220片段可以被总定量引物扩¬增。Y定量引物可以特异性扩增人Y染色体的多拷贝片段DYS14，男性人类基因组的一条Y染色体上平均约有22 个DYS14片段可以被此引物扩增，而人类女性基因组中不含有能够被Y定量引物扩增的片段。在不同人群中，DUF1220和DYS14的拷贝数稍有差异（CV约为20-25%），能够满足定量需求。
 
在每个人二倍体细胞中存在约6.6 pg的基因组DNA，包含约110个DUF1220片段，即每个双链DNA DUF1220拷贝对应0.06 pg的人源DNA。在每个人类男性的二倍体细胞中包含约22个DYS14片段，即每个双链DNA DYS14拷贝对应约0.3 pg 的男性人源DNA。通过对DUF1220片段和DYS14片段的分别定量，可以计算出其中总人源DNA的含量和其中人源男性DNA的含量。
 
试剂盒中所包含的人DNA定量标准是用已知序列的双链DNA片段配比得到的一份模拟DNA标准品，并不包含人基因组DNA。此标准品较由单人或多人样品中提取的基因组DNA要更加稳定，不易在反复冻融或长期储存中产生浓度变化。同时，不使用含有人基因组DNA的标准样品也排除了在应用时污染待测样品的可能性。

   定量指标与性能

本部分的指标与性能均以酷搏科技q225荧光定量PCR仪的测试标准给出，包括定量范围和重复性。如用户使用其它qPCR定量系统，按照其使用和维护要求进行校准，并设置参数合适时，也可以得到类似的指标和性能。
 
如需更多与本试剂盒和q225荧光定量PCR系统相关的指标和性能相关的技术信息（如与试剂盒相关的：混合样品中男女DNA浓度的定量，其它物种的干扰，抑制剂的影响，在其它qPCR仪上的测试结果等；与q225荧光定量PCR系统相关的：仪器的温度和Ct准确性以及应用方式、应用特点等），请联系酷搏科技。
 
推荐应用定量范围
01
图1：使用单一来源男性DNA样品进行梯度稀释，样品浓度范围为100 ng/μl – 2 pg/μl。实验体系为10 μl，每一浓度8个平行反应，每一反应中包含样品1 μl。在此浓度区间内DUF1220和DYS14两种方法线性拟合的R2分别为0.9978和0.9973，线性良好
定量重复性
 下表为不同操作人员、不同仪器之间的重复性比较。四次实验分别由两个实验人在两台q225荧光定量PCR仪上完成。每次实验包括一组定量标准曲线 (20 ng/μl – 0.078 ng/μl，五个浓度)、两个单一来源女性DNA待测样品（F1, F2浓度分别约为6.4 ng/μl和0.10 ng/μl）、两个单一来源男性DNA待测样品（M1, M2浓度分别约为13 ng/μl和0.16 ng/μl）和一个阴性对照。四次实验所用标准样品原液 (20 ng/μl样品) 及4个待测样品均相同，不同操作人之间使用各自梯度稀释标准溶液测定标准曲线。
 
实验编号
样品名称
 总DNA定量 Y DNA定量
Ct
样品中DNA浓度 (ng/μl)
Ct
样品中DNA浓度(ng/μl)
1
F1
18.389±0.002
6.38±0.01
未扩增
未检出
F2
24.880±0.060
0.096±0.004
未扩增
未检出
M1
17.297±0.013
12.9±0.1
19.691±0.015
11.8±0.1
M2
24.049±0.051
0.164±0.005
26.651±0.109
0.127±0.009
2：相同操作人在相同仪器上重复实验
F1
18.391±0.014
6.39±0.06
未扩增
未检出
F2
24.789±0.053
0.103±0.004
未扩增
未检出
M1
17.302±0.012
12.9±0.1
19.690±0.009
11.9±0.1
M2
24.057±0.040
0.165±0.004
26.531±0.041
0.132±0.004
3：相同操作人在不同仪器上重复实验
F1
18.441±0.011
6.39±0.05
未扩增
未检出
F2
25.001±0.040
0.091±0.002
未扩增
未检出
M1
17.370±0.007
12.8±0.1
19.803±0.031
11.3±0.2
M2
24.077±0.050
0.165±0.005
26.648±0.018
0.135±0.002
4：不同操作人在相同仪器上重复实验
F1
18.341±0.010
6.62±0.04
未扩增
未检出
F2
25.067±0.131
0.095±0.008
未扩增
未检出
M1
17.242±0.005
13.2±0.0
19.716±0.024
11.4±0.2
M2
24.025±0.032
0.183±0.004
26.546±0.037
0.151±0.004
 
 
下表为实验2-4结果与实验1的定量结果差异百分比。对于浓度较高样品 （F1, M1），测得浓度差异小于4%。对于浓度较低样品（F2,M2），同一实验员相同仪器及不同仪器间，测得浓度差异均小于8%；不同实验员间测得浓度差异小于20%。
实验编号
样品名称
总DNA定量
Y DNA定量
Ct (%)
样品中DNA浓度 (%)
Ct (%)
样品中DNA浓度 (%)
2：相同操作人在相同仪器上重复实验
F1
0.01
0.05
--
--
F2
0.37
7.91
--
--
M1
0.03
0.39
0.01
0.94
M2
0.03
1.04
0.45
4.50
3：相同操作人在不同仪器上重复实验
F1
0.28
0.11
--
--
F2
0.49
5.20
--
--
M1
0.42
1.00
0.57
3.83
M2
0.12
0.92
0.01
6.48
4：不同操作人在相同仪器上重复实验
F1
0.26
3.67
--
--
F2
0.75
0.41
--
--
M1
0.32
2.24
0.13
2.89
M2
0.10
11.92
0.39
19.35
 
 

   注意事项

  • 确认操作人员接受过基本的分子生物学实验培训。
  • 确认操作人员在使用本试剂盒进行检测前，认真阅读并理解本使用说明。
  • 确保操作人员双手佩戴一次性乳胶手套或者丁腈手套，并避免佩戴手套时触摸任何身体部位。
  • 使用本试剂盒进行人源DNA定量实验时，请远离DNA样品提取区域和PCR产物后处理区域。

   操作流程

开始操作前
在得到纯化的DNA样品且确定所有的仪器和材料均就位后，请明确：1. 需要测定的项目（总人源DNA含量和/或男性人源DNA含量）；2. qPCR反应的重复数。如果只需进行总人源DNA的定量，则无需进行男性DNA检测。
 
在样品的体积足够时，建议对每一qPCR反应进行2个重复（使用酷搏科技q225荧光定量PCR系统时）或3个重复（使用其它荧光定量PCR仪器时）。当实验目的并非为仪器或试剂盒的性能测试时，重复数多于3个一般是不必要的。不进行重复实验则无法估计测量的不确定性，也无法发现操作上可能出现的错误。
 
标准样品与阴性对照样品的准备
试剂盒中包含浓度相当于20 ng/μl人类基因组DNA的定量标准样品1管。将试剂从冷冻保存处取出，待溶液融化后震荡混匀，建议使用纯水进行4倍连续梯度稀释，得到从20 ng/μl至0.0078 ng/μl的5种不同浓度样品，即可用以配制反应溶液进行标准曲线实验。具体的标准样品稀释方法见下文。
  • 将试剂盒内的标准样品于室温下融化，置于漩涡混匀仪上震荡3-5秒后离心。
  • 根据表4对标准样品进行4倍浓度梯度稀释，得到5个不同浓度的标准样品。稀释过程中每一步需在漩涡混匀仪上震荡至少5秒，并在震荡后离心使得管内液体全部集中在管底后再进行下一步移液。
样品浓度(ng/μl) 从上一浓度样品内吸取液体体积(μl) 纯水体积 (μl)
20 原始标准溶液 -
5.0 20 60
1.25 20 60
0.312 20 60
0.078 20 60
 
如果用户使用同一批号的本试剂盒，在q225荧光定量PCR仪上运行，且保证操作步骤、试剂配比完全一致的情况下，并保证试剂盒的存储条件得当，则可以不在每一次运行时都包括标准样品，而是使用相同条件下的一次标准曲线来进行定量。在此时，运行中仅需要包括原始的20 ng/μl标准样品作为阳性对照，以及用DNA洗脱液阴性作为阴性对照（见下文）即可。
 
在使用本试剂盒的不同批次间不能互相调用标准曲线。如果用户或者使用了与之前的标准曲线不同的样品稀释或配制方法，或者在非q225荧光定量PCR仪上使用本试剂盒时，必须在运行时包括5个连续稀释得到的不同浓度标准样品和阴性对照。
 
建议用户在每次定量过程中，使用当批DNA样本提取时的洗脱溶液（若提取不包含洗脱步骤，则使用溶解DNA的最后一步提取试剂）作为阴性对照进行实验。如因为实验设计原因或其它原因，无法使用当批DNA洗脱液作为阴性对照的，可以用本试剂盒中的纯水当作阴性对照，但无法判断是否在DNA提取步骤中存在污染的信息。
 
 
 qPCR反应溶液的配制
  1. 取出试剂盒内的2x qPCR反应液，总定量引物和Y定量引物，于室温下融化。震荡混匀各引物溶液，手持上下颠倒或使用移液器吹打温和混匀2x qPCR反应液。混匀后将各管试剂离心。
  2. 依据下表计算实验所需各组分体积（建议每种溶液按所需体积的1.1倍计算，已包括在表中），加入体积合适的离心管后震荡混合均匀，离心。
 
组分 每一样品每种引物实验所需体积（μl）*
总定量引物或Y定量引物 8.8
2x qPCR反应液 11
 
*表中所示为每一样品每种引物进行两个平行反应且每个反应总体积为10 μl时所需溶液体积（故对于每一样品每种引物需配制20 μl反应溶液）。如使用其它荧光定量PCR系统，需要进行三个平行反应或使用其他反应体积时，请自行根据比例增加用量。后文所提及用量同理，不再赘述。

c. 将离心后的混合溶液加入到离心管或八联排管内，每管加入18 μl。注意记录各管内所加溶液包含的引物种类。
d. 每个反应孔板内要求包含至少一份阴性对照和一份阳性对照，可直接使用试剂盒内的20 ng/μl定量标准品作为阳性对照。将充分混匀且离心后的标准样品（如需做标准曲线时）、待测样品、阴性对照和阳性对照加入到已添加混合溶液的各离心管或八联排管内，每管加入2 μl。注意记录各管所加样品名称。完成后盖好各管，充分震荡混匀，离心。
e. 取出q225专用小型96孔板，每管溶液分配至两个孔内，每孔加入9 μl。此步骤推荐使用手动或电动多通道移液器进行。完成后使用配套封板膜密封孔板，离心除去孔内气泡并使得溶液集中于管底。
 
 设置和开始qPCR反应
将孔板放入q225荧光定量PCR仪准备进行实验，默认的qPCR反应程序设置参见表5。q225荧光定量PCR仪的使用参见q225荧光定量PCR系统使用说明。
 
步骤名称 进行次数 温度 (°C) 时间 (s)
预变性 1次 98 60
循环反应 40次 98 5
60 15
熔解曲线 1次 60-95  约5 min
 
 
 
如使用q225荧光定量PCR系统配套的人源DNA定量分析软件，则已经在软件中集成了反应条件相关的设置。用户只需输入或从电子表格中粘贴样品名称并设定其对应的孔板位置即可。

   数据处理与分析

如用户使用q225荧光定量PCR系统配套的人源DNA定量分析软件，则会在运行完成后的结果中给出样品的浓度结果，以及对结果中存在的问题做出分析和判断。
 
 阴性对照
当阴性对照样品的Ct值大于32时，体系可被认为是没有人源DNA污染的。
 
如对于特定方法（总人DNA或男性DNA），阴性对照的Ct值低于32，但样品的Ct值比阴性对照要小3以上，表明在DNA提取或定量操作中带来了一些人源污染，但是污染程度较样品中的DNA浓度低很多，不会显著影响定量结果。
 
若全部阴性对照样品的Ct值均在27（总人DNA）或 29（男性DNA）以下，则意味着体系存在着显著的人源DNA污染，定量结果是不可靠的。
 
若在连续数次实验中，阴性对照样品的Ct值持续小于30，可使用标准样品试剂盒中提供的纯水进行阴性对照实验，以便确定污染来自于基因定量试剂盒中的组分或DNA提取过程中所使用的试剂。
 
 标准曲线
一般而言，总人源DNA定量和人男性DNA定量标准曲线的R2在0.99以上（一般为0.995 -1.000范围）。扩增效率在0.80 - 1.10之间（一般为0.90 - 1.00之间）。
 
如果用户使用同一批号的试剂盒在q225荧光定量PCR仪上运行，保证操作步骤、试剂配比完全一致的情况下，并保证试剂盒的存储条件得当，则可以不在每一次运行时都包括多个稀释的标准浓度样品，而是使用相同条件下之前的一次标准曲线来进行定量。此时使用q225荧光定量PCR系统配套的人源DNA定量分析软件导入之前包含了相应标准曲线的运行文件，可以给出样品浓度。
 
阳性对照
使用q225荧光定量PCR仪，阳性对照为20 ng/μl定量标准品时，人源DNA定量（DUF1220）的Ct值范围在15.8-17.2之间（一般在16.1-16.8之间），男性DNA定量（DYS14）的Ct值范围在18.1-19.5之间（一般在18.4-19.1之间）。如在其它非q225仪器上进行定量，或溶液配比与操作步骤不同，或使用其它样品作为阳性对照时，均不可参考此标准。
 
重复间差异
在Ct<25时，两个重复孔间的Ct差异低于0.5（一般低于0.3）。Ct在25-28时，重复孔间Ct差异低于1.0（一般低于0.5）。如二者差异过大，需要寻找原因，并根据对浓度准确度的要求，合理剔除问题孔，或者重新测定浓度。计算出每孔的总人源DNA浓度和男性DNA浓度后，按照各自浓度的平均值和标准差给出结果。
 
熔解曲线与解链温度
DUF1220（总定量引物）和DYS14（Y定量引物）扩增片段的解链温度在q225上的参考值为80.2 °C和81.6 °C，在熔解曲线的负一阶导数图上显示较尖锐的单峰。解链温度一般仅作为参考，但如果离参考值偏差较大（DUF1220小于79°C或大于81.5°C， DYS14小于80°C或大于83°C），或者出现DYS14比DUF1220的熔解温度低，可能表明存在非特异扩增，或者反应液配制错误等。如使用其它荧光定量PCR系统时，可能因为仪器状态、温度校准等因素偏离此值。
 
02
图2：总定量引物（DUF1220，蓝色）和Y定量引物（DYS14，橙红色）的熔解曲线负一阶导数示意。

  使用非q225系统

酷搏科技人源DNA定量试剂盒可以在除q225以外的常见荧光定量PCR仪上使用。使用时请根据不同仪器要求自行加入参比试剂（如合适浓度的ROX）、适当延长qPCR各步骤时间（建议每步骤延长15 s - 30 s）及增加反应体积（如使用常规96孔板，可使用20 μl - 50 μl的总反应体积）。荧光读取在60 °C的末尾进行，可以使用FAM、SYBR或光谱相近的光学通道。本试剂盒的试剂中不包括ROX染料。如用户根据仪器的要求加入了合适浓度的ROX，可以进行ROX校正。
 
用户使用其它荧光定量PCR仪时，必须每次运行时都包括相应的稀释曲线，并用log(浓度)对Ct值进行线性拟合的方法，对同次运行的样品Ct计算浓度。在非q225系统中使用本试剂盒时，建议对每个反应进行3个重复，以提高结果的准确度。
 

  常见问题

 
现象
可能原因及解决方案
平行反应间Ct值差异大
移液系统误差较大。建议重新校准移液系统，并配合合适的移液吸头。
使用移液器量程范围内较低区间的移液体积（例如使用0.5 – 10 μl移液器移取1 μl以下液体）。在此区间内移液器准确度可能会有所降低，因此建议每次移液操作移取2 μl以上的液体，可以适当稀释相关溶液以便增大移液体积。
反应溶液中的模板DNA浓度较低时平行反应间的统计误差也会相应增大。较高Ct值样品(Ct > 25)有可能会有较低Ct值样品更大的标准差。浓度过低的样品(Ct > 30)可能无法用以进行STR分型。在有可能进行进一步STR分型的浓度范围内使用本试剂盒一般可以给出准确的定量。
样品在加入孔板之前未充分混匀。建议每一步混合样品后使用震荡混匀器充分混匀再进行后续操作。
孔板未完全封严导致反应液部分或全部蒸发。建议使用官方推荐的孔板封膜方式进行封膜（q225专用小型96孔板封膜操作相关视频见酷搏科技官方网站）。
阴性对照样品中出现扩增且Ct小于30
若熔解峰位置与阳性对照扩增产物相同，则为人源DNA片段的污染。人源DNA可能来自于被污染的试剂（如提取时的DNA洗脱液、平衡液等）、耗材（如使用劣质的样品管、吸头）、环境（如实验室环境较脏，或曾将之前完成的qPCR反应打开）、操作人（如未佩戴手套直接操作，打喷嚏或在操作时触摸身体或面部）等等。彻底清洁实验台及移液器并更换新的试剂，实验过程中佩戴一次性无粉乳胶或丁腈手套、口罩、发套等防护品，并严格规范操作。并注意在远离DNA提取及PCR产物后处理区域进行定量实验。
如使用试剂盒中的纯水做阴性对照，Ct值也一致且连续的低于28，表明此已开封试剂盒已被人源DNA污染。请使用新的定量试剂盒，并注意以上事项，排除污染源后进行实验。
扩增曲线出现明显折线
孔内气泡未除净。在开始实验前仔细检查孔板内气泡是否除净，并使用孔板离心机离心除泡。若仍有部分孔内含有气泡或未配备离心设备，可以适当延长qPCR反应过程中的热激活时间，使气泡在循环开始前破裂。
扩增曲线及熔解曲线未见显著荧光值变化
样品中不含人源DNA，或已经几乎完全降解。基因组DNA在经过提取后，冻存在-20 °C一般可以稳定至少6 - 12个月。DNA酶、高温、紫外线、强辐射、酸性环境等因素会破坏或降解DNA。
反应溶液中缺少一种或多种组分，或未加入待测样品。核对实验步骤或重新进行该样品的定量。
在软件中设置孔板时标记错误。核对实验记录中各样品在孔板中的位置并将孔板从仪器中取出进行检查。
封膜不严导致反应溶液完全蒸发。取出孔板进行检查，若为此原因建议使用官方推荐的孔板封膜方式进行封膜（q225专用小型96孔板封膜操作相关视频见酷搏科技官方网站）。
样品中存在高浓度的PCR抑制剂。对待测样品重新进行纯化，可考虑使用其他提取方法以便更好地除去PCR抑制剂。若样品浓度可能较高，也可考虑对样品进行一定倍数的稀释后再进行定量。
标准曲线线性差（R2小于0.99）
输入浓度与实际浓度不符。核对实验记录中的各标准样品浓度与软件中录入浓度是否一致。
标准样品浓度过低或稀释比例过低。使用试剂盒说明书中建议的稀释比例配制标准样品。
标准样品未能准确按照实验方案进行稀释。核对实验记录检查是否有操作错误或重新校准移液器。稀释之前确保起始样品完全融化并混合均匀。稀释过程中确保每一步混合充分，每步之后更换吸头。建议使用较大体积并避免更换移液器，例如使用10 - 100 μl量程移液器将20 μl标准样品加入到60 μl纯水中进行4倍稀释。
样品稀释或反应溶液配制过程中出现人源污染或样品间交叉污染。此时低浓度的点Ct值会明显偏小。人源DNA可能来自于被污染的试剂（如提取时的DNA洗脱液、平衡液等）、耗材（如使用劣质的样品管、吸头）、环境（如实验室环境较脏，或曾将之前完成的qPCR反应打开）、操作人（如未佩戴手套直接操作，打喷嚏或在操作时触摸身体或面部）等等。检查稀释所使用的纯水的洁净度或更换新的纯水。更换新的试剂。清洁实验台及移液器。实验过程中佩戴一次性无粉乳胶或丁腈手套、口罩、发套等防护品，并注意在远离DNA提取及PCR产物后处理区域进行实验。注意操作浓度较高的标准样品时避免手套或移液器除吸头以外的部分接触样品，若发生接触则需立即更换手套或清洁移液器。避免浓度较高的样品溅出或遗洒于实验台，若发生则需立即清洁实验台。
使用不洁净的板膜以致影响荧光检测。避免在孔板内样品孔上方的膜上写字，避免在操作过程中接触孔上方的板膜上表面。封板膜之前确认膜上无灰尘、污迹、划痕或指纹等。
标准曲线实验中计算所得扩增效率过低（扩增效率小于0.80）
输入浓度与实际稀释浓度不符。核对实验记录中的各标准样品浓度与软件中录入浓度是否一致。
标准样品未能准确按照实验方案进行稀释。核对实验记录检查是否有操作错误或重新校准移液器。稀释之前确保起始样品完全融化并混合均匀。稀释过程中确保每一步混合充分，每步之后更换吸头。建议使用较大体积并避免更换移液器，例如使用10 – 100 μl量程移液器将20 μl标准样品加入到60 μl纯水中进行4倍稀释。
试剂未在适当条件下保存或超出有效期。检查试剂有效期及保存条件，更换新的试剂。
标准曲线实验中计算所得扩增效率过高（扩增效率大于1.10）
输入浓度与实际稀释浓度不符。核对实验记录中的各标准样品浓度与软件中录入浓度是否一致。
标准样品未能准确按照实验方案进行稀释。核对实验记录检查是否有操作错误或重新校准移液器。稀释之前确保起始样品完全融化并混合均匀。稀释过程中确保每一步混合充分，每步之后更换吸头。建议使用较大体积并避免更换移液器，例如使用10 - 100 μl量程移液器将20 μl标准样品加入到60 μl纯水中进行4倍稀释。
样品稀释或反应溶液配制过程中出现人源污染或样品间交叉污染。此时低浓度的点Ct值会明显偏小。人源DNA可能来自于被污染的试剂（如提取时的DNA洗脱液、平衡液等）、耗材（如使用劣质的样品管、吸头）、环境（如实验室环境较脏，或曾将之前完成的qPCR反应打开）、操作人（如未佩戴手套直接操作，打喷嚏或在操作时触摸身体或面部）等等。检查稀释所使用的纯水的洁净度或更换新的纯水。更换新的试剂。清洁实验台及移液器。实验过程中佩戴一次性无粉乳胶或丁腈手套、口罩、发套等防护品，并注意在远离DNA提取及PCR产物后处理区域进行实验。注意操作时浓度较高的标准样品时避免手套或移液器除吸头以外的部分接触样品，若发生接触则需立即更换手套或清洁移液器。避免浓度较高的样品溅出或遗洒于实验台，若发生则需立即清洁实验台。
某男性纯DNA样本的的男性DNA浓度和总人DNA浓度的测量结果有差别
如二者浓度比例在2倍以内或稍超出2倍，一般是正常现象。在测试过的几个样本库中，男性样本的DUF1220与DYS14的拷贝数均存在一个分布，本试剂盒的比例中值是以中国人平均值来设定的。某些族裔男性DNA的样本也可能存在比值的差别。一般二者浓度比例在2倍以内，可以认为是正常现象，不足以说明男性DNA在总人DNA中的比例。
部分表型为男性样本的基因型为XYY或其它类别。这种现象并不常见（< 0.5%）。
样品浓度非常低，仅检测到DUF1220，未检测到DYS14。由于人基因组中DUF1220拷贝数比DYS14高，如样品浓度接近或低于0.5 pg/μl，则可能存在样品只检测到DUF1220，而未检测到DYS14的情况。
存在接近或高于此样品浓度的人源污染。此时阴性对照的对应Ct值会与此样品接近。人源DNA可能来自于被污染的试剂（如提取时的DNA洗脱液、平衡液等）、耗材（如使用劣质的样品管、吸头）、环境（如实验室环境较脏，或曾将之前完成的qPCR反应打开）、操作人（如未佩戴手套直接操作，打喷嚏或在操作时触摸身体或面部）等等。检查稀释所使用的纯水的洁净度或更换新的纯水。更换新的试剂。清洁实验台及移液器。实验过程中佩戴一次性无粉乳胶或丁腈手套、口罩、发套等防护品，并注意在远离DNA提取及PCR产物后处理区域进行实验。注意操作浓度较高的标准样品时避免手套或移液器除吸头以外的部分接触样品，若发生接触则需立即更换手套或清洁移液器。避免浓度较高的样品溅出或遗洒于实验台，若发生则需立即清洁实验台。
操作出现错误，例如反应液中未加入样品，或加入样品体积错误。可再次测量此样品浓度以确认不是操作错误。
 
 
 

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