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q225的Ct值是怎么来的?为什么要这样做?

q225的Ct值是通过拟合计算而来的。每条曲线通过一个理想qPCR曲线的公式拟合后,得到了几个参数:扩增前的背景荧光强度,扩增后的平台期荧光强度和一些代表曲线形状的参数。

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原始数据

 

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拟合和归一后

 

q225的默认阈值是扩增达到10%平台期时的荧光强度。Ct即为qPCR曲线与阈值交点的热循环数。•用曲线拟合相当于用这次的扩增曲线对光学做了一次自校正,减小了光学系统的偏移和环境对扩增曲线的影响。

 

这样计算Ct值有依据吗?

关于曲线拟合计算Ct的方法在许多文献中都有过报道。最早的例子包括:

Liu,W., & Saint, D. A. (2002). Validation of a quantitative method for realtime PCR kinetics. Biochemical and biophysicalresearch communications, 294(2),347-353.

 

Tichopad,A., Dilger,M., Schwarz, G., & Pfaffl,M. W. (2003). Standardized determination of real‐timePCR efficiency from a single reaction set‐up. Nucleic acids research, 31(20),e122-e122.

 

这两篇文献已被引用了数百次。还有数十篇文献讨论了类似的qPCR拟合方法。

此外,根据我们大量的实验也表明用拟合方法得出的Ct准确性和可重复性要比许多仪器的默认方法要好。

 

用曲线拟合计算Ct值的好处是什么?

提高了结果的准确度

提高了在仪器间和位置间的可重复性

减轻了对操作环境的需求(少量灰尘等不影响结果)

仪器长期不需要校正(少量的光学偏移和灰尘会被拟合公式校正,不会越用越不准)

降低对绝对定量中标准曲线的要求(不一定需要每板做)

 

q225的Ct可以跟其它仪器相比较吗?

Ct结果差异不会太大,但具体差多少基本上取决于在其它仪器上的设定

对于q225而言,只要qPCR体系和程序相同,基本上Ct(默认10%的Ct)只跟模板浓度相关,与仪器、位置、仪器的新旧和校准等基本无关。

其它很多仪器的算法中,阈值高低是可以人为拖动的,每次运行之间、仪器在数次运行间、仪器和仪器间会有所差异,而阈值的设定直接决定了Ct。尽管如此,很多仪器的阈值会习惯大致设在5%-30%间的范围内。因此q225给出的Ct会跟其它仪器接近。

 

q225的Ct可以不设成10%,可以设成其它值吗(例如20%)?

可以,但一般没有必要。在菜单分析-阈值里,可以设成0.01-0.99之间的任何值,代表1%-99%。但请选中相同Assay的所有样品孔,做同样的阈值更改。

在运行结束后的修改完成后,需要菜单文件-保存来保存修改结果,否则修改不被保存。

 

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