实验结果中，孔与孔之间平行样品的差异比较大。可能的原因有以下几个：
A. 操作相关的原因
1. 移液原因
尽可能增加移液体积，减少移液误差
例如，方法1：管中混好mix、引物和样品，再加入孔板中；方法2：只把mix、引物混好加入孔板中，然后再加一次样品。
两种方法都可以，一般推荐方法1
方法1的移液体积更大，移液误差较小，在q225上反应出的重复间差别更小，在样品数少的时候操作更简单。
方法2因为移液体积较小，可能存在孔间少量的移液误差；操作上需要增加混匀步骤。但是因为每个孔的加样操作也重复过一次，有更大的可能性能够分辨出操作错误。在样品数较多的时候操作更简单。
用小体积时，不要完全按照大体积时的配比，需要把最少的组分体积加大。
例如，用5 μl反应，加0.5 μl的样品的推荐方法是：将2x qPCR mix与引物混合，不加入水或buffer（例如一起共3 μl），再加入2 μl稀释后的样品。
通过优化流程，尽量减少小体积移液来减轻。5ul体系例子：
--0.5ul sample+4.5ul (mix+buffer) – CV 5.1%
--2 ul (sample+buffer) + 3 ul mix – CV 1.5%
--预混匀6 ul sample + 9 ul mix，再分成三份 – CV 0.9%
2. 样品混合原因
多次加样后需要进行混匀，具体方法是
封好膜后将样品甩到膜上，再甩回孔底数次混匀。也可以用vortex上下混匀数次，但小心vortex橡皮掉渣！
在q225孔板中直接混合样品，再分配到其他几个平行的孔中，会导致结果偏差较大。
例如，做5 μl * 3的重复时，在q225孔板的一个孔中混好15 μl的体系，然后再吸2个5 μl到旁边孔里，这样是不对的
原因：q225孔板的体积较小，比普通的96孔板或排管更难混匀
同时在小体积孔中做重复吹吸操作时，容易产生溢出或气溶胶污染
3. 孔中存在气泡
孔中存在气泡，并在反应过程中发生破裂，导致荧光强度发生突变，对结果产生影响。
如下图所示，该孔中存在一个气泡，并在第12个循环时发生破裂，导致荧光强度发生突变。
建议您在放入孔板前对孔中的液体进行观察，如果有气泡没有除去，请参考 如何除去孔中的气泡 进行除泡操作。
4. 封膜不严，部分孔中的液体蒸发
实验完成后取出孔板进行观察，如果发现存在孔的液体明显减少，甚至液体完全蒸干，说明板膜密封不严。
在扩增曲线上，表现为基线显著的向上或向下倾斜，或者该扩增的样品没有出现扩增曲线。
孔板加完样后的封闭方法：使用配套的手动封膜器和板膜封闭。板膜揭开保护层后是没有粘性的，用力刮/压后产生粘性，可以封住孔板。具体操作请见演示视频。
B. 样品原因
5. 模板分子的随机分配
在每个孔平均只有1-100个，甚至不到1个模板分子的时候（Ct在28-36的范围），重复间的差别会变大。这是每个DNA模板分子在分配时的随机分布带来的影响。
在低模板浓度时，污染和非特异性扩增，也更容易影响结果。
这种情况经常发生在做单细胞的DNA/RNA定量的时候。如果注意并排除了上述因素，是可以用多拷贝基因做单细胞浓度定量的。
降低模板随机分配误差对qPCR的影响：提高模板浓度、增加重复数、加入多种引物同时扩增
6. 样品中双链DNA起始浓度过高（使用双链DNA染料时）
使用双链DNA染料法时（如Sybr-Green），模板中双链DNA会结合SYBR Green，导致背景较高，定量准确度下降。
在gDNA作为模板时比较明显。
建议双链DNA浓度不高于20 ng / 10 ul 。
10 ul体系中含有1-20 ng human gDNA时，对单拷贝基因，每孔中有约300 - 6000 dsDNA copies，Ct在20-25范围，可以准确定量。
C. 试剂/程序设置原因
6. 热激活时间不够
许多早期开发的试剂（2005年前）热激活步骤需要较长的时间，例如5-10 min。此时用q225的默认热激活时间（2 min）效果不好。将热激活时间设成10 min就好了。
大部分快速qPCR试剂热激活步骤时间在0-3 min，使用q225的默认程序即可。
7. 延伸时间不够
q225采用小型96孔板，孔壁和液体厚度变薄，贴合也更好，液体能够更快达到设定温度。因此q225默认的程序相比传统qPCR仪器每个步骤少5-30 s。
通常延伸时间取决于qPCR试剂（例如酶的种类与酶浓度、离子浓度等等）与引物、扩增产物设计，用户需要自行验证。
非快速的qPCR/PCR试剂，以及较长的产物可能需要更长一些的延伸时间，但可以按照试剂说明书，比96孔、20-25 μl体系每个步骤减少5-30 s来尝试。
8. Probe实验中，探针的浓度不合适，或探针发生变质
探针实验的探针浓度和体系需要进行优化。通常推荐的探针浓度在50-500nM。
如果探针浓度过低，则荧光增长较少，结果准确度下降。
如果探针浓度过高，则起始荧光背景过高，后期导致仪器检测器饱和，同样会导致结果准确度下降。
建议用户在q225上尝试新体系之前，先使用若干个不同浓度的探针体系在q225上进行测试，根据结果选择合适的探针浓度。
如果探针发生变质，则会导致起始荧光背景过高，而荧光增长较少，导致结果准确度下降。
图：探针浓度过高
图：探针浓度减半后